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鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結合，通常用來標記組織切片，細胞培養(yǎng)物或無細胞體系中的F-actin，從而對F-actin進行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環(huán)肽分子的計量比結合。且非特異性結合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進行相關研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未標記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應；鬼筆環(huán)肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結構，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品為TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標記的鬼筆環(huán)肽，染色反應特異性強，對比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測。另外，經(jīng)本品結合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學特性。且本品的結合沒有物種差異性，適用性廣泛。

產(chǎn)品性質(zhì)：

操作步驟

1.  工作液準備：對于TRITC標記鬼筆環(huán)肽。本品以溶于甲醇的20µM儲存液形式提供，總量為300µl。按照100 nM的工作液濃度來換算，可制備總量為60ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。按照100nM濃度來計算，可進行300次細胞染色。

2.  染色步驟

A：細胞爬片生長24h，使其密度達到50%匯合度。

B：吸掉培養(yǎng)液，37℃預熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細胞2次。

C：使用溶于PBS的4%甲醛溶液進行細胞固定，室溫固定10min。 【注意】：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。

D：室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10min。

E：室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

F：室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10min。

G：取200µl配制好的TRITC標記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。 注意：為了降低背景，可于TRITC標記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。

H：用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

I：使用200µl DAPI溶液（濃度：100 nM）對細胞核進行復染，約30s。

J： 用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標本玻片可置于4℃避光保存，通常6個月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

K： 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察，選擇TRITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=545/570nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項

1：鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量LD50約2mg/kg）。

2：為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。